熒光光譜技術是一種通過測量物質(zhì)吸收光后發(fā)射的熒光光譜來研究物質(zhì)性質(zhì)的技術。本文根據(jù)《JY-T 0571-2020》，簡單總結了熒光光譜分析測試或分析方法原理。

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1熒光定性定量分析原理

熒光分析主要是指利用某些物質(zhì)在特定波長光的激發(fā)下，產(chǎn)生特定波長和特定強度熒光等的特性進行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。

注：定量分析僅限于稀溶液樣品，一般不直接用于固體樣品定量分析。

1.1定性分析

常采用直接比較法，將樣品的激發(fā)和發(fā)射光譜峰的數(shù)目、位置、強度以及光譜形狀（極值和拐點）、發(fā)射光譜壽命等特征，與標準物的譜圖作比較，以確定物質(zhì)種類。

1.2定量分析

定量分析原理參見GB/T 19267.3和《中華人民共和國藥典》（2015年版）（四部）0405熒光分光光度法，包括標準對照法和標準曲線法。

注：在實際應用中，應考慮內(nèi)濾效應對熒光強度的影響。

2熒光量子產(chǎn)率分析原理

熒光量子產(chǎn)率的測定有參比法和絕對法兩種。

2.1參比法

也稱相對法，是用已知量子產(chǎn)率的熒光標準物質(zhì)作為參比對待測熒光試樣進行量子產(chǎn)率的測試。在相同激發(fā)條件下，分別測定待測熒光試樣和參比熒光標準物質(zhì)兩種稀溶液的積分熒光強度（即校正熒光光譜所包括的面積），以及對該激發(fā)波長人射光的吸光度，再將這些值分別代入公式（1）進行計算：

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2.2絕對法

采用積分球?qū)晒饬孔赢a(chǎn)率進行測量，適用于液體、固體、薄膜和粉末樣品，目前一般測試波長范圍為300 nm~800nm。待測樣品各個方向的發(fā)射光經(jīng)過積分球均勻化后從出射口出來，并經(jīng)過單色器最后被檢測器所檢測。測定時，分別測定待測熒光試樣和空白試樣的熒光峰面積和激發(fā)峰面積（均為校正后）再將這些值分別代入公式（2）進行計算：

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3熒光偏振分析原理

熒光偏振（P）和熒光各向異性（r）定義為公式（3）和公式（4）。

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4熒光壽命分析原理

熒光壽命的測試一般采用時間相關單光子計數(shù)法（time correlated single photon counting），簡稱“TCSPC法”；或相調(diào)制技術，也稱為“頻域法（frequency-domain method）”；或頻閃分時法，簡稱"STROBE”法。TCSPC、頻域法和STROBE的具體原理參見附錄A。在當今實際應用中，TCSPC法和STROBE 方法互為補充。

5時間分辨熒光光譜分析原理

獲得時間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜（time-resolved excitation/emission spectra，TRES）的常用技術有；采用多波長掃描獲得一系列的衰減曲線，而后對應特定時間寬度做時間切片后，獲得時間分辨激發(fā)/發(fā)射光譜；對應的測試技術有boxcar（取樣積分技術）、TCSPC等；直接測量方法，采用可以采集光譜的多道檢測器，比如 ICCD（intensified charge-coupled device）、條紋相機、微通道板（multiple channel tube，MCP）等，經(jīng)過光譜儀色散后，直接獲得一系列設定時間寬度的瞬時光譜。

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